Экспериментальные измерения термической стерилизации пищевых продуктов в реторт-пакетах

Цель этой статьи — подтвердить теоретические предсказания распределения температуры, разрушения витамина С и инактивации бактерий (Bacillus stearothermophilus) во время стерилизации пищевых продуктов в пакетах.

Измерение температуры в реторт-пакетах

Измерения распределения температуры в пакете проводились в научно-исследовательской лаборатории HeinzWatties Australasia, расположенной в Гастингсе, Новая Зеландия. Температура в разных местах пакета, наполненного морковно-апельсиновым супом, измерялась в течение всего периода стерилизации. При измерениях использовались следующие оборудование и материалы: 1. Пакеты, наполненные морковно-апельсиновым супом, производства Heinz Watties Australasia 2. Реторта опытной установки Easteel — процесс полного погружения 3.

Датчик термопары с разъемами типа “G”, длина 7 м, игла 80 × 1,2 мм2 4. Система проверки и мониторинга процессов (ELLAB) с программным обеспечением E-Val 5. Ноутбук IBM ThinkPad 600 Pentium II 6. Источники питания 110-240 В, 50/60 Гц 7. Пластиковые детали (сальники) длиной 15 мм, 35 мм и 40 мм, используемые для удержания термопары в чехлах 8. Скользящий контакт с 12 каналами в комплекте с соединительными кабелями 9. Регистратор температурных данных с 16 каналами 10. Интерфейсные и коаксиальные кабели с Т-образными штекерами и концевыми разъемами.

Один пакет, наполненный супом, был помещен в недавно разработанную реторту с программным обеспечением для проверки и мониторинга, работающим на ноутбуке IBM ThinkPad 600 Pentium, для анализа всех измерений. Реторта работает с использованием насыщенного пара при температуре 121°C. Измерения проводились для одного пакета шириной 120 мм, высотой 40 мм и длиной 220 мм, аналогичного тем, которые использовались при моделировании.

Пакет помещали на поднос в горизонтальном положении и нагревали в течение 50 минут для полной стерилизации. Общее время всего процесса стерилизации морковно-апельсинового супа составило 5400 секунд. Первые 3600 с были потрачены на цикл нагрева, еще 600 с — на выдержку, а оставшиеся 1200 с — на цикл охлаждения для завершения процесса стерилизации. Датчики-термопары были размещены в разных местах упаковки для измерения распределения температуры внутри упаковки. Для проведения измерений датчики-термопары были подключены к регистратору температурных данных с 16 каналами. Температуру измеряли в плоскости z (рис. 6.2), которая находилась на расстоянии 8 см от самого широкого конца пакета, и в точках x-y (0,50 см, 0,75 см), (3,00 см, 1,75 см) и (6 см, 2 см). Наконечники, используемые для крепления зондов-термопар, имели разную высоту — 15 мм, 35 мм и 40 мм. Результаты измерений для полной стерилизации (т.е. цикл нагрева, время выдержки и цикл охлаждения) были нанесены на график.

Кривые нагрева и охлаждения обычно используются для описания температурной зависимости консервов во время стерилизации; они используются для определения правильных режимов нагрева консервированных продуктов (Хаякава и Болл, 1969). В ретортах с насыщенным паром температура и давление регулируются для удаления воздуха, который может находиться в системе (т.е. для вентиляции). Не удаленный воздух может привести к локальному понижению температуры внутри реторты. Это хорошо видно на рисунке 8.1 в точке измерения (x = 0,50 см, y = 0,75 см и z = 8,00 см), расположенной близко к стене, которая является более чувствительной, чем точки, измеренные в других местах.

Измерение температуры во время цикла нагрева

  На рисунке 8.1 показана измеренная температура в разных местах пакета, наполненного морковно-апельсиновым супом и нагреваемого конденсирующимся паром, за период от 0 до 60 мин. На нем показано значительное распределение температуры в пакете в течение всего периода нагревания. Такие результаты указывают на то, что одного измерения температуры недостаточно для определения степени стерильности продукта. На рисунке показано хорошее соответствие между измеренной и рассчитанной температурами у стенки, независимо от того, основан ли расчет на теплопроводном нагреве или на комбинированном конвекционно-теплопроводном нагреве. На рисунках показано сравнение между измеренными температурами в двух местах, удаленных от стенки пакета, и температурами, полученными в результате компьютерного моделирования. Оба этих показателя показывают гораздо лучшее соответствие между измерениями и прогнозами, основанными на конвекционно-кондуктивном нагреве, по сравнению с чисто кондуктивным нагревом.

На рисунке показано, что прогнозируемая температура выше, чем измеренная. Это может быть связано с искажением торроида, вызванным конвективной циркуляцией, как это хорошо видно на рисунках 6.10d–6.10f, которое возникает в том же месте расположения термопары, используемой при измерении. На рисунке показано сравнение между измеренной температурой в зоне самого медленного нагрева (SHZ) пакета и температурой, полученной в результате компьютерного моделирования в другом месте. На этом рисунке, а также на рисунке ясно показано, что прогнозируемая температура в банке выше, чем измеренная экспериментально. Вероятно, это связано с использованием датчиков температуры большого размера, что приводит к уменьшению естественного конвективного движения в процессе нагрева. Исходя из этого, мы пришли к выводу, что измерения, обычно проводимые в промышленности с использованием такого большого датчика, могут привести к неточной оценке времени стерилизации.

Измерение температуры во время цикла охлаждения

На рисунке 8.5 показано распределение измеренной температуры в разных местах (в тех же местах, которые использовались в цикле разогрева) в пакете, наполненном морковно-апельсиновым супом, во время цикла охлаждения.Для охлаждения использовалась вода при температуре 20°C. На рисунке показано существенное распределение температуры в пакете в течение всего периода охлаждения. За время выдержки (60-70 мин) температура пакета существенно не изменилась, как показано на рисунке 8.1. Максимальное изменение температуры SHZ за время выдержки составило всего 0,4°C. Соответственно, температура в конце периода нагрева использовалась в качестве начальной температуры в период охлаждения при моделировании. Как упоминалось ранее, важно влияние времени выдержки на инактивацию бактерий. Во время охлаждения после термической обработки температура поверхности контейнера не будет совпадать с измеренной температурой воды, используемой для охлаждения.

Ричардсон и соавторы провели несколько исследований. (1988), которые прикрепили поверхностные термопары к поверхности банки в дополнение к другим местам, стремясь улучшить результаты измерений, чтобы их можно было использовать для оценки результатов моделирования. При их моделировании в модель был включен коэффициент поверхностной теплопередачи, равный 600 Вт/м2 К−1. Это значение было выбрано из литературы и подтверждено расчетами на основе измерений температуры поверхности и имеющейся корреляции вида Nu= f (Gr×Pr)n, где Nu — число Нуссельта, безразмерное; Gr — число Грасхофа, безразмерное; Pr — это число Прандтля, безразмерное; а f — коэффициенты нагрева или охлаждения (Tucker, G.S. and Clark, P. 1990).  

Экспериментальные данные по термической обработке также были подвержены трем хорошо документированным проблемам, возникающим при охлаждении (Tucker и Cfdra):

1. Кипение может быть вызвано слишком ранним падением давления в реторте на этапе охлаждения, когда температура в центре все еще превышает 100°C. Это приводит к частичному выкипанию содержимого и последующему снижению температуры и перемещению продукта, при этом более холодные поверхностные слои перемещаются в основную часть банки. Следовательно, регистрируется большее падение температуры в этой зоне, чем было бы в случае лучшего контроля за сбросом давления (Teixeira et al., 1985). На рисунке показано падение температуры в местах, прилегающих к стене, что, следовательно, приводит к более быстрому охлаждению, наблюдаемому во всех других местах. Это может объяснить более высокие скорости охлаждения, наблюдаемые экспериментально по сравнению с прогнозируемыми.

2. Охлаждающая вода под давлением может быть подана в корпус термопары (Cleland and Gesterkamp, 1983), если резьбовое соединение слегка ослаблено. Впоследствии по датчику из нержавеющей стали будет проходить ток, что приведет к искусственному понижению температуры. В системе, использованной в наших экспериментах, эта проблема не ожидалась из-за герметичности датчиков-термопар и используемого современного оборудования.

3. Проводимость по самому датчику из нержавеющей стали может привести к более быстрому снижению измеряемой температуры внутри контейнера (т.е. пакета). В наших экспериментах мы не ожидали возникновения этой проблемы из-за тонкого провода термопары.

Анализ разрушения витамина С

Измерения степени разрушения витамина С были разделены на два этапа. На первом этапе пять упаковок с морковно-апельсиновым супом были стерилизованы при различных периодах нагрева — 0 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 40 мин и 50 мин соответственно. Стерилизация пакетов проводилась в научно-исследовательских лабораториях Heinz Watties в Австралазии. Использовалось то же оборудование и материалы. После стерилизации каждого образца в течение определенного периода времени из каждого из пяти пакетов были взяты дубликаты образцов в дополнение к образцам, взятым из нестерилизованного пакета. Содержащиеся в нем образцы были запечатаны и хранились в холодильнике с достаточной светозащитой. Вторая часть работы, включающая анализ содержания витамина С, была проведена на факультете пищевых наук Оклендского университета.

Оборудование и материалы, использованные при анализе

Были протестированы образцы морковно-апельсинового супа, приготовленного на разные сроки стерилизации. При анализе витамина С использовались следующие оборудование и материалы: Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и станция HPCHEM со сбором данных, версия A.06.01 [403], работающая на системе HP1100, которая состоит из: дегазатора HP1100, автосамплера HP1100, четвертичного насоса HP1100. Термостат колонки HP1100 _ Детектор на диодной матрице HP1100 (DAD) _ Колонка C18 (PHENOMENUX типа LUNA 5U C [18], 250 × 460 мм) _ Метафосфорная кислота в 0,01 н. H2SO4 _ Стандартные образцы чистой аскорбиновой кислоты с 2,6-дихлориндофенолом _ Аналитические весы (METTLER Toledo Ag204, d = 0,1 мг) _ Миксер (мини–шейкер IKA MSI) _ Центрифуга (SORVALL RC 28S) _ Блендеры (WARING 8010S, 8000-12000 об/мин) _ Гомогенизатор (IKA LABORTECHNIK T2S, 8000-24000 об/мин) _ Мерный цилиндр, бюретка (50 мл), воронка Бюхнера и стаканы, такие как мензурки и мерная колба с фильтровальной бумагой

Метод ВЭЖХ

Ряд образцов, холостых и стандартных, были протестированы методом ВЭЖХ с использованием системы HP1100, доступной на факультете пищевых наук Оклендского университета. В этом методе рабочими условиями ВЭЖХ были скорость потока 0,7 мл в минуту, ультрафиолетовый (УФ) детектор (установленный на 245 нм), инъекция 20 мкл, подвижная фаза в соотношении 55:45 метанола к воде и колонка C18. В экстрагирующем растворе были приготовлены две нормы аскорбиновой кислоты — 0,067 и 0,013 мг/мл. Пик, обусловленный витамином С, наблюдался через 3,6-4,0 минуты, как показано на рисунках 9.6 и 9.7, после пиков, обусловленных растворителем-носителем (метафосфорной кислотой).

Для оценки концентрации витамина С в супах использовались площади пиков содержания витамина С в начальных сериях. В стандартных сериях пик был довольно широким, но в образцах супов он, как правило, был более резким. При анализе методом ВЭЖХ для каждого пика были получены полные спектры в УФ- и видимом диапазонах, а также записаны площади и высоты пиков. Было обнаружено, что в образцах soup можно было увидеть до 12 отдельных пиков, как показано на рисунке 8.8. Это было связано со сложным составом тестируемого супа. На основании полученных результатов было решено не использовать метод ВЭЖХ для анализа.

Титриметрический метод определения 2,6-дихлорфенолиндофенола

Измерение аскорбиновой кислоты путем прямого титрования 2,6-дихлориндофеноловым красителем является наиболее часто используемым методом, поскольку он прост и быстр (Albrecht and Schafer, 1990). Международный стандарт ISO 6557/2 (1984) и AOAC (1980) определяют два стандартных метода определения содержания аскорбиновой кислоты во фруктах и овощах: 1. Титриметрический метод определения 2,6-диклорфенолиндофенола 2. спектрометрический метод определения 2,6-диклорфенолиндофенола после экстракции ксилолом В данном исследовании использовался титриметрический метод определения 2,6-диклорфенолиндофенола. Принцип заключается в экстракции аскорбиновой кислоты из исследуемого образца раствором щавелевой кислоты или метафосфорной кислоты (уксусной кислоты) с последующим титрованием 2,6-диклорфенолиндофеноловым красителем до получения лососево-розового цвета.

Приготовление экстракционного раствора

В качестве экстрагирующего раствора используется 0,3%-ная метафосфорная кислота в 0,01 н. H2SO4. Раствор готовят следующим образом: 1. Отвешивают 0,6 г метафосфорной кислоты. 2. Добавьте его к 200 мл 0,01 н. H2SO4 в мерную колбу. 3. Гомогенизируйте полученный раствор с помощью магнитной мешалки в течение 5-6 мин или более до полного растворения метафосфорной кислоты. Извлечение аскорбиновой кислоты из образцов супа Для извлечения аскорбиновой кислоты из образцов супа используется следующий метод: 1. Измельчите 10 г супа в блендере. 2. Добавьте 40 мл прилагаемого экстрагирующего раствора (0,3% метафосфорной кислоты в 0,01 н. H2SO4). 3. Гомогенизируйте раствор, перемешивая не менее 2-3 минут. 4. Центрифугируйте гомогенат в течение 4-5 минут при 3000 оборотах в минуту. Это связано со сложной консистенцией вязкого жидкого пищевого продукта. 5. Отфильтруйте полученный гомогенат через воронку Бюхнера под вакуумом. 6. Используйте еще 5 мл экстрагирующего раствора для промывки блендера. 7. Перелейте раствор в мерную колбу объемом 50 мл и доведите до нужной концентрации, используя экстрагирующий раствор. Возьмите 10 мл аликвот для титрования индофенолом.

Приготовление раствора аскорбиновой кислоты для стандартизации В экстрагирующем растворе используют три стандартных образца аскорбиновой кислоты (0,3% метафосфорной кислоты в 0,01 н. H2SO4) для построения калибровочной кривой. Они составляют 0,067 мг/мл, 0,050 мг/мл и 0,013 мг/мл. Готовится проба объемом 100 мл, из которой для титрования требуется всего 10 мл. Приготовьте раствор 2,6-диклорфенолиндофенолового красителя на основе официального метода AOAC, используя следующие этапы: 1. Растворите 42 мг гидрокарбоната натрия (NaHCO3) в 50 мл дистиллированной воды в мерной колбе емкостью 200 мл. 2. Добавьте 50 мг 2,6-диклорфенолиндофенола. 3. Энергично встряхивайте, пока краситель (2,6-диклорфенолиндофенол) не растворится. 4. Разбавьте дистиллированной водой до 200 мл. 5. Перемешайте раствор и перелейте его в бюретку объемом 50 мл, готовую к титрованию.

Титрование

  Из каждого образца берут три аликвотные порции и титруют 10 мл каждой пробы раствором красителя до получения лососево-розового оттенка, который сохраняется не менее 5 с. Проводят три определения на тестовых порциях, взятых из одного и того же образца. Каждый раз записывайте объем использованного красящего раствора. Объемы раствора индофенола, необходимые для титрования трех стандартных образцов аскорбиновой кислоты (см. раздел 8.2.2.2.3), составляли 11,0 мл, 8,2 мл и 2,0 мл соответственно.

Эти значения были нанесены на график для построения калибровочных кривых аскорбиновой кислоты. В методе титрования использовали образцы супа, нагреваемые в течение различных периодов времени ( 0, 10, 20, 30, 40, и 50 мин), приготовленные, как описано в разделе 8.2.2.2.2.2. Средние арифметические объемы раствора красителя (2,6-диклорфенолиндофенола), необходимые для этих образцов, составили 5.9, 5.7, 5.5, 5.2, 4.7, и 4,3 мл соответственно.

Согласно калибровочной кривой аскорбиновой кислоты (рисунок 8.9), эти объемы эквивалентны 0.72, 0.71, 0.68, 0.64, 0.60, и 0,55 мг аскорбиновой кислоты соответственно, что соответствует концентрациям 0.072, 0.071, 0.068, 0.064, 0.060, и 0,055 мг/мл соответственно. Разделив каждое значение, полученное по калибровочной кривой, на исходное, мы получаем относительные концентрации 100%, 96.8%, 91.15%, 84.64%, 78.44%, 70.85%. Эти значения были нанесены на график и сравнены с прогнозируемыми значениями на рисунке, который показывает хорошее соответствие между прогнозом и экспериментальными измерениями. 

Подсчет спор после термообработки

Экспериментальные измерения для определения количества спор B. stearothermophilus после термической обработки пакетов, наполненных говяжье-овощным супом, были проведены в лаборатории биотехнологии на химико-технологическом факультете Оклендского университета. При измерениях использовались мешочки того же размера, что и те, которые использовались в теоретическом анализе. Целью было подтвердить теоретические предсказания об инактивации спор B. stearothermophilus. Ниже приводится краткое описание методов и процедур, используемых при подсчете спор B. стереотермофиллы, которые были собраны и затем помещены в пакеты. Была разработана и проведена процедура проверки, чтобы убедиться, что как среда, так и используемые виды бактерий выдерживают термическую обработку. Процедура валидации также позволила определить методы, с помощью которых можно было бы получать суспензии спор для инъекций в суповые пакетики.

Оборудование и материалы, использованные при измерениях

Для измерений использовались следующие материалы и оборудование: 1. Маточная культура B. stereothermophillus. 2. Споровый агар (питательная среда для спороношения) — это среда, используемая для стимулирования прорастания спор Bacillus, которые выдержали процедуру термической обработки. Эта среда содержит соли металлов, дрожжевой экстракт и питательную агаровую основу в следующем соотношении: Состав (ингредиенты на литр): Питательный агар (обезвоженный Difco) — 23,0 г, Солевой раствор — 5,0 мл, Дрожжевой экстракт — 0,5 г, солевой раствор (ингредиенты на литр) — CaCl2 — 15,54 г, MnCl2 · 4H2O — 1,98 г. _ MgCl2 · 6H2O 40,66 г Способ приготовления этой среды заключается в следующем: 1. Приготовьте достаточное количество солевого раствора и отложите его в сторону. 2. Отдельно разведите питательный агар дистиллированной водой (23 г на литр) и добавьте дрожжевой экстракт (0,5 г на литр). 3. Добавьте раствор соли (5 мл на литр) и стерилизуйте в автоклаве в течение 15 минут при температуре 121°C. 4. Пакетики с говяжье-овощным супом производства Heinzwatt Australasia, Гастингс, Новая Зеландия. 5. Чашки Петри, в которые помещалась питательная среда. 6. Пакетики для разведения и перемешивания супа после термической обработки. 7. Петли, которые использовались для нанесения спорообразующей культуры на споровый агар, чтобы ее можно было использовать в дальнейшем. 8. Шприцы, используемые для введения спор в суповые пакетики. 9. Пипетки и наконечники для пипеток, используемые для последовательного разведения суспензии спор и разведенного супа. 10. Весы (SARTORIUS BP1105, Biolab Scientific Limited, не более 110 г, d = 0,1 мг). 11. Газонагревательные элементы, используемые для нагрева скороварки для обеспечения условий испытания (насыщенный пар при температуре 121°C). 12. Скороварка (ООО «ТТК Престиж», объем 12 л). 13. Миксер (AutoVortex MixerMt19, Childern Scientific), который использовался для гомогенизации суспензий, разлитых по пробиркам. 14. Автоклавы (TOMY Auto calve SS-325) используются для стерилизации оборудования и расплавления агара при температуре 121°C в течение 15 минут. 15. Использовали две водяные бани (GRANT W28, Grant Instrument Cambridge Limited, Англия), первая из которых была установлена при температуре 100°C для подготовки спор, а вторая — при температуре 45°C для выдерживания агара при этой температуре, чтобы предотвратить его желатинизацию. 16. Инкубатор (GALLENKAMP, экономичный инкубатор с вентилятором 2-го размера, Watson Victor Ltd, Новая Зеландия), используемый для инкубации чашек Петри при температуре 55°C. 17. Стерилизационная лента, используемая для запечатывания пакетов после инъекции спор.

Процедура проверки

Исходную культуру спор B. stereothermophillus дополнительно культивировали на споровом агаре, чтобы гарантировать рост бактериальных клеток на этой среде. Затем эти культуры помещали в холодильник, чтобы стимулировать образование спор внутри бактериальных клеток, которые впоследствии можно было собирать и вводить в суповые пакетики.

Валидация метода культивирования спор/питательных сред

Первым протоколом, разработанным для этой серии практических занятий, была оценка эффективности и жизнеспособности используемых сред (питательная среда для спороношения) и бактериальной культуры (исходная культура для B. stereothermophillus) способность к образованию спор. Это также позволило бы нам определить метод, с помощью которого можно было бы собирать споры. В этой работе споры не отделялись от мертвых клеток для получения чистой споровой суспензии, поскольку это потребовало бы нескольких стадий центрифугирования и фильтрации. Предполагалось, что термическая обработка вегетативных клеток исходной культуры приведет к высвобождению спор и разрушению вегетативных клеток, что позволит нам получить пригодную для использования суспензию спор (Balows et al., 1991; Starr et al., 1981). При валидации метода культивирования спор и питательной среды использовали следующий протокол: 1. Агар-агар расплавляли при температуре 121°C в течение 15 минут. 2. Перенесите бактериальные клетки из исходной культуры в несколько пробирок со стерильной водой, используя пластиковую петлю, чтобы получить клеточную суспензию, которая позже будет подвергнута термической обработке для получения суспензии спор. 3. Нагрейте клеточную суспензию, полученную на этапе 2, при температуре 100°C в течение 10 минут, чтобы уничтожить вегетативные клетки и высвободить споры. Время (10 мин) было выбрано на основе времени тепловой обработки, которое использовалось в описанном методе подсчета спор (Balows et al., 1991; Starr et al., 1981). 4. Приготовьте 9 мл стерильной воды для проведения последовательных разведений. Ожидается, что количество присутствующих спор будет очень высоким, поэтому требуется достаточное количество из этих 9 мл, чтобы мы могли разбавить их до 109. Для последовательного разбавления необходимо добавить 1 мл суспензии в 9 мл воды. Это, в свою очередь, приводит к 10-кратному разбавлению исходной суспензии. Из этого 10-кратного разведения 1 мл добавляют еще в 9 мл воды, что приводит к 100-кратному разбавлению исходной суспензии. Этот процесс повторяют (последовательные разведения) до тех пор, пока исходная суспензия спор не будет разведена в 109 раз. 5. Из каждого разведения дозируйте по 1 мл в стерильные чашки Петри (одна чашка на разведение). После того, как все растворы будут разведены, разлейте по этим чашкам 10-15 мл питательного спороносного агара (NSA). Осторожно встряхните чашки, чтобы споры распределились по всему агару и их было легче подсчитать. 6. Поместите чашки Петри, полученные на этапе 5, в пластиковые пакеты/гильзы и инкубируйте при температуре 55°C в течение 3 дней. Чашки Петри помещают в пакеты, чтобы предотвратить обезвоживание агара при такой температуре. 7. Через 3 дня осмотрите чашки на предмет роста колоний спор. Предполагается, что каждая колония, образующаяся в чашке Петри, развилась из одной споры или колониеобразующей единицы. Следовательно, подсчет количества бактериальных колоний и умножение этого числа на коэффициент разбавления позволит нам оценить количество спор или колониеобразующих единиц, присутствующих в исходной спорообразующей суспензии. Это первоначальное исследование было организовано для того, чтобы убедиться в совместимости используемой среды и бактериальной культуры. По этой причине количество клеток, присутствующих на чашках, не имело значения. Ключевым моментом здесь было обеспечение совместимости среды и B. stereothermophillus.

Проверка времени термообработки

Протокол, использованный в этой работе, был разработан для проверки воспроизводимости результатов с использованием того же метода, что и вышеописанный. Это также определило оптимальное время термообработки для “сбора урожая” спор из исходной культуры. Цель состояла в том, чтобы воспроизвести различные периоды экспозиции при температуре 100°C, что дало нам основу для сравнения и средство, с помощью которого мы могли бы оценить жизнеспособность нашего метода. Было решено использовать три временных интервала при температуре 100°C, которые составили 10, 20 и 30 минут соответственно. Процедура проверки этого протокола была следующей:

1. Растопить агар-агар при температуре 121°C в течение 15 минут.

2. Приготовьте инокуляты/суспензии спор (тяжелые в том смысле, что большое количество клеток переносится из исходной культуры на чашке Петри в объем стерильной воды), а затем распределите их по шести пробиркам (по 5 мл в каждую пробирку).

3. Подготовьте пробирки с водой объемом 9 мл для последовательных разведений, как описано в шаге 4 предыдущего раздела. Подготовьте чашки Петри для различных последовательных разведений.

4. Нагрейте две пробирки с исходным раствором при температуре 100°C в течение 10, 20 и 30 минут, как описано выше.

5. Сразу после термообработки охладите пробирки в ледяной воде. Это необходимо для предотвращения прорастания спор до того, как они будут помещены в NSA. В этом случае возможно деление живых клеток, и результат может не соответствовать действительному количеству спор, присутствующих в суспензии.

6. Проведите последовательные разведения каждого исходного образца после термообработки, чтобы получить определенное количество спор.

7. Разлейте NSA в чашки Петри и встряхните, как в шаге 4 предыдущего раздела.

8. Инкубируйте чашки при температуре 55°C в течение трех дней. После инкубации подсчитайте количество колониеобразующих единиц на каждой чашке, чтобы определить количество спор, присутствующих в каждом из термообработанных исходных растворов.

Результаты, представленные в таблице, представляют собой средние значения для каждого тестируемого интервала времени. Каждое число соответствует количеству колониеобразующих единиц, подсчитанных на каждом планшете (чашке Петри) при различных разведениях. Значение <1 указывает на то, что колонии не подсчитывались, но из-за небольшого объема исследуемого образца невозможно определить нулевое количество колоний. Буква “TN” указывает на то, что количество колониеобразующих единиц было слишком велико, чтобы их можно было сосчитать.

Из приведенных выше результатов мы можем видеть, что метод очень воспроизводим и что споры способны сохраняться при температуре 100°C не менее 30 минут. Соответственно, было решено использовать температуру 100°C в течение 30 минут для подготовки спор к остальной части этой практической работы, поскольку это время гарантировало бы, что после термообработки вообще не останется вегетативных клеток. Следует отметить, что во время этого исследования исходная культура была помещена в чашки Петри, чтобы можно было сравнить количество клеток до и после термической обработки.

Тестирование в реторт-пакетах

Был проведен подсчет спор для следующего: a. Исходного раствора спор, чтобы получить исходное количество спор, которые были введены в суповые пакетики. b. Суповые пакетики, наполненные говяжье-овощным супом, нагревались в течение различных периодов времени ( 5, 10, 15, 20, 25, и 30 минут по Цельсию). Пустой пакет для супа, наполненный только супом, для каждого из указанных выше интервалов тестирования, чтобы убедиться, что в супе не было спор, при подсчете спор B. stearothermophilus, которые вводились в пакеты, наполненные говяжье-овощным супом, и нагревались в разное время, использовался следующий протокол:

1. Разлейте по 9 мл стерильной воды в пробирки для последовательного разведения всех образцов, подлежащих тестированию, а также подготовьте чашки Петри и наклейте на них этикетки, чтобы можно было дозировать полученные серийные разведения.

2. Приготовьте исходный раствор спор/клеток в 300 мл воды. Смешайте все это с помощью взбалтывания, а затем храните на льду до готовности к употреблению.

3. Приготовьте суспензию спор, для чего разделите клеточную суспензию на шесть пробирок. Нагревайте эти пробирки при температуре 100°C в течение 30 минут, чтобы уничтожить все живые клетки и оставить только споры, которые будут использованы в данном исследовании. После завершения термообработки поставьте пробирки на лед, чтобы предотвратить размножение спор.

4. Используйте по два пакетика на каждый промежуток времени. Инокулируйте/вводите в первый пакетик 5 мл суспензии спор, полученной на этапе 3, сохраняя при этом второй пакетик неповрежденным (споры не попадают внутрь). После этого тщательно встряхните пакетики и поместите их в скороварку. Нагрейте воду в скороварке до получения насыщенного пара при температуре 121°C. Положите пакеты на металлическую подставку, возвышающуюся над уровнем воды в скороварке. Это делается для обеспечения равномерного прогрева пакетиков за счет конденсирующегося пара, а не за счет кипящей воды.

5. По завершении процесса термообработки положите пакетики на лед, чтобы предотвратить споруляцию (прорастание спор). После того как пакетики остынут, встряхните их и разбавьте содержимое в 10 раз стерильной водой. Для этого перелейте 25 г супа из пакетика в пакет для запекания и добавьте его в 225 г воды, чтобы получить 10-кратное разбавление.

6. После этого первоначального разведения выполните последовательное разведение и помещайте по 1 мл из каждого разведения в стерильную чашку Петри, наполненную агаром. Для зараженных суповых пакетиков разведите бульон от 102 до 107, в то время как для незараженного супа разведите бульон от 102 до 104. В то же время, возьмите на пробу только те споры (SO), которые были получены на начальной стадии термообработки, чтобы подсчитать количество спор, которые присутствовали в исходных посевных материалах.

7. Затем инкубируйте чашки Петри при температуре 55°C в течение 72 ч. После инкубации подсчитайте количество колониеобразующих единиц на каждой чашке, чтобы определить количество спор, присутствующих в каждом образце.

При использовании последовательного разведения после 30-минутной стерилизации количество спор не было обнаружено, поэтому в это время было невозможно подсчитать количество спор. Были получены следующие результаты. Пять миллилитров жидкости, содержащей споры, вводили в пакет объемом 500 мл для получения коэффициента разбавления, равного 100. Этот коэффициент был умножен на коэффициент последовательного разведения, чтобы получить итоговое количество спор, оставшихся в супе после применения условий тестирования. Исходя из вышеизложенного, были получены следующие результаты (таблица 8.3) по количеству спор.  

Средние относительные концентрации бактерий (спор B. stearothermophilus) во всем пакете, полученные в результате компьютерного моделирования, снизились до 24.85%, 3.34%, 0.43%, 0.056%, 0.0079%, и 0.7 × 10-3% (0.61, 1.48, 2.37, 3.25, 4.10, и уменьшение бревенчатости на 5,15) после нагрева периоды 300, 600, 900, 1,200, 1,500, и 1800 секунд соответственно. Эти значения приведены на рисунке 8.12 для сравнения, что показывает очень хорошее соответствие между экспериментальным и теоретическим прогнозом степени стерилизации.