Методы характеристики кристаллизации в процессах сублимационной сушки

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

ДСК использовали для изучения термического поведения растворов сахарозы, мальтозы и кофе во время кристаллизации в диапазоне концентраций (10-70% твердых веществ). В исследовании использовались два прибора ДСК: один — Perkin Elmer DSC 7, другой — Mettler Toledo DSC 2. Взвешивали около 5 мг (20 мг в случае Mettler Toledo DSC 2) исследуемого раствора (точная масса записывали) и запечатывали в алюминиевый поддон емкостью 40 мкл, затем помещали в ДСК. В качестве эталона использовали запечатанную пустую кастрюлю. В исследовании ДСК использовались различные температурные циклы; они будут упомянуты в результатах и ​​обсуждении (для образцов сахарозы/мальтозы и кофе соответственно).

Крио-рентгеновская дифракция (крио-XRD)

Крио-XRD использовался для характеристики кристаллов во время кристаллизации воды в концентрированных растворах сахарозы/кофе. Примерно 0,01 мл исследуемой системы вводили с помощью шприца и иглы в капиллярную трубку из боросиликатного стекла диаметром 1 мм (Capillary Tube Supplies Ltd). Капилляр фиксировали на штативе для образцов вертикально синей липкой лентой, с большой осторожностью центрировали гониометром, а затем переносили в порошковый дифрактометр (Siemens D5000), оснащенный низкотемпературным криопотоком Oxford.

Угол сканирования во всех экспериментах был установлен на уровне 20–50° (кроме случаев, когда указано иное), чтобы охватить идентичные пики кристаллов льда. В экспериментах по XRD для изучения влияния термической обработки (скорости охлаждения) на кристаллизацию воды, как обсуждается ниже, использовались три различные скорости охлаждения/нагрева в диапазоне от 0,1°C/мин до 6°C/мин.

Скорость охлаждения 6˚C/мин — это самая высокая скорость охлаждения, которую может достичь дифрактометр D5000 с криопотоком. Его использовали в экспериментах с сахарозой (20%, 50% и 70%) и кофе (50% и 70%). Температуры сканирования были выбраны на основе температуры фазового перехода образца в соответствии с предыдущими исследованиями ДСК и литературными данными.

Сканирующий электронный микроскоп в криосреде (ESEM)

СЭМ — широко используемый метод определения характеристик микроструктуры образцов. Однако его нельзя использовать для исследования образцов, содержащих воду/лед, из-за возможного ущерба от испарения воды при таком низком давлении (104 Па) в камере СЭМ (Онг, Дагастин и др., 2011). Травление, удаление льда с поверхности образца путем сублимации при более высокой температуре (например, -95°C), обычно проводится во время подготовки образца к СЭМ (Хиндмарш, Рассел и др., 2007, Онг, Дагастин и др., 2011). Затем наносится металлическое покрытие (например, золото) для улучшения контрастности и разрешения микроскопического изображения (Онг, Дагастин и др., 2011). Тогда поры, образовавшиеся в результате сублимации льда, считаются того же размера, что и кристаллы льда, образовавшиеся в замороженном образце (Флорес и Гофф, 1999, Хиндмарш, Рассел и др., 2007, Мусави, Мири и др., 2007). Это способ косвенного изучения кристаллов льда. Однако в этой работе были предприняты усилия по визуализации кристаллов льда напрямую, чтобы минимизировать изменение структуры во время сублимации льда.

Изображения были получены с помощью ESEM, немного другого метода, который позволяет наблюдать сильно гидратированные образцы. Cryo ESEM (Philips XL30 ESEM-FEG) использовался для наблюдения кристаллов льда в замороженном образце. Были приготовлены замороженные образцы сахарозы и кофе, которые хранились замороженными в лаборатории в течение одного дня перед экспериментом по СЭМ. Затем образец помещали в термоизолированный мешок (Sofribag), который заполняли сухим льдом и передавали в лабораторию электронного микроскопа. Благодаря хорошей изоляции и низкой температуре, обеспечиваемой сублимацией сухого льда, таяние образца во время переноса не наблюдалось.

Подготовка образцов для исследования СЭМ проводилась с большой осторожностью, а время воздействия образцов на окружающую среду было сведено к минимуму, чтобы в образце меньше таяли кристаллы льда. Перед пробоподготовкой все инструменты (включая молоток, лезвие и пинцет) погружались в жидкий азот для поддержания низкой температуры.

Замороженный образец извлекали из изотермического мешка и разбивали молотком на мелкие кусочки. Небольшие кубики измельченного образца (объемом примерно 1 мм3) сразу погружали в жидкий азот. В ходе дробления в каждом образце создавались плоскости излома. Был выбран один кубический образец и наклеен на штифт СЭМ плоскостью излома вверху. Затем его перенесли в камеру СЭМ.

Рабочая температура камеры была ниже -170°С, но перед исследованием образца ее повышали до -95°С и выдерживали в течение 5 минут для травления образца с целью удаления намерзшего льда. Выбор времени и температуры травления был основан на опыте и методе проб и ошибок, чтобы удалить большую часть инея, образующегося на поверхности при раздавливании и приклеивании образца к штифту СЭМ, не теряя при этом всех кристаллов льда, образовавшихся при замерзании.

Затем образец был исследован методом СЭМ при температуре -170°C с использованием электронного луча напряжением 3 кВ. Небольшое напряжение электронных лучей по сравнению с другими исследованиями СЭМ было выбрано для уменьшения перегрева образца и предотвращения его зарядки. Этот процесс позволил получить как минимум 20 четких изображений при различном увеличении, прежде чем наблюдалась очевидная зарядка образца.

В одном эксперименте с 50%-ным образцом замороженного кофе дальнейшее травление проводилось при -70°C в течение 30 минут. Затем образец напыляли золотом для лучшей проводимости, а затем снова изучали под электронным микроскопом. При расширенном травлении все кристаллы льда в образце сублимировались, и поэтому можно было увидеть структуру образца без кристаллов льда.

Кристаллизация с добавлением зародышей

Кристаллизацию дополнительно изучали в условиях индуцированной кристаллизации воды путем добавления ядер льда в систему замораживания. Эксперименты проводились в двух масштабах. В небольшом масштабе (капли по 0,1 мл) эксперименты проводились под микроскопом для наблюдения за кристаллизацией in-situ. В большем масштабе (образец 2 мл) образцы оставляли кристаллизоваться при разных температурах и исследовали конечную лиофилизированную систему.

Небольшие эксперименты по индуцированной кристаллизации были проведены в системах сахарозы, гуммиарабика и кофе. Детали экспериментальной установки и анализа данных приведены ниже.

Разработан оптический метод исследования кинетики роста кристаллов индуцированной кристаллизации под микроскопом. Устройство, показанное на рисунке 3-4, сочетало в себе этап контроля температуры с оптическим микроскопом и камерой для визуализации изменений в образце во время кристаллизации. Для обеспечения точного контроля температуры использовался столик Пельтье (Linkam, LTS 120). Оптический микроскоп Leica позволял детально рассмотреть образец, а к микроскопу была подключена камера для записи изображений во время экспериментов со скоростью 1 кадр в секунду.

Были поставлены эксперименты по изучению скорости роста кристаллов льда в концентрированных системах при различных степенях переохлаждения, где зародышеобразование не было спонтанным, путем добавления уже образовавшихся зародышей льда в переохлажденные растворы.

Одну каплю (0,1 мл) концентрированного образца помещали на предметное стекло (диаметром 9 мм) и на предметный столик Пельтье. Капля заполнила полость на предметном стекле, при этом поверхность имела минимальную кривизну по сравнению со случаем, если бы капля была помещена на плоское предметное стекло, что улучшало качество изображения. Объем капли был выбран методом проб и ошибок для получения изображений оптимального качества. Капли большего размера приводили к размытым и расфокусированным изображениям из-за увеличения кривизны капли или даже переполнения стеклянной полости, тогда как капли меньшего размера были слишком малы для измерения роста кристаллов. Небольшую каплю (3 мкл) зародышеобразователя помещали рядом с предметным стеклом на столик охлаждения (размер зародышей был выбран для удобства). Затем камеру Пельтье закрывали крышкой и столик охлаждали со скоростью 1°С/мин до заданной температуры для получения необходимого переохлаждения. Скорость охлаждения была установлена ​​на уровне 1°C/мин, чтобы соответствовать предыдущим экспериментам DSC и XRD. Когда температура достигала выбранного заданного значения, зарождающаяся капля вмораживалась в ледяную гранулу, образуя зародыш, а материнский раствор находился в виде переохлажденной жидкости. Затем ядро ​​добавляли в центр переохлажденной капли с помощью пинцета и регистрировали рост кристалла (1 кадр/с) с помощью камеры и программного обеспечения (μ-manager). Записанные изображения впоследствии анализировались для определения скорости роста кристаллов (мм/мин).

В качестве систем, в которых происходила кристаллизация, использовали растворы сахарозы (40, 50 и 60%), гуммиарабика (50, 60%) и растворы сахароза/КМЦ (0,5 и 1% КМЦ). Cmc является загустителем и был добавлен для изучения влияния вязкости на кинетику роста кристаллов. Зародыши льда формировались либо из 10%-ного раствора сахарозы (для экспериментов с сахарозой), либо из дистиллированной воды (для экспериментов с гуммиарабиком).

Обработка данных

Типичное изображение микроскопа показано на рисунке. Светлая область в центре представляет собой кристаллизованную область, которая со временем увеличивается. Более темная область, окружающая кристалл, представляет собой переохлажденную жидкость, и со временем по мере роста кристалла она становится меньше. Яркий круг является отражением освещения микроскопа и не учитывался при обработке изображений.

Влияние размера зародыша на кинетику роста кристаллов

Были проведены предварительные эксперименты, чтобы проверить влияние размера ядра на скорость роста кристаллов льда. Были протестированы три различных объема ядра (1, 3 и 5 мкл), и результаты для 60% раствора сахарозы, кристаллизующегося при -20°C, показаны на рис. 3-7. Результаты показали незначительное влияние на кинетику роста кристаллов. В следующих экспериментах использовался размер семени 3 мкл, поскольку меньшее семя (1 мкл) было трудно перенести в жидкость, а более крупное (5 мкл) имело больший первоначальный размер по сравнению с каплей.

Дальнейшее развитие получил метод исследования влияния кинетики кристаллизации на микроструктуру лиофилизированных систем. В этих экспериментах использовалось 50, 60% образцов кофе.

Ядра льда получали в камере быстрой заморозки путем нанесения пипеткой капель дистиллированной воды объемом 5 мкл на холодную поверхность. После полного замерзания они служили ядрами льда.

Образец объемом 2 мл помещали в контейнер, накрывали пластиковым изолятором и охлаждали до -5°С со скоростью 1°С/мин на столике Пельтье. Когда температура образца достигла -5°C, в кофе добавили 6 ядер льда и слегка перемешали. В этом эксперименте добавка зародышей льда составляет 1,5% от общей массы образца.

В качестве температуры для добавления зародышей была выбрана температура -5°C, поскольку при этой температуре зародыши льда не таяли в образце, а в 60% кофе не образовывались самопроизвольно. Затем смесь накрыли изолятором и охладили до заданной температуры.

Образец выдерживали при температуре кристаллизации в течение 30 минут, чтобы обеспечить рост кристаллов, а затем переносили в камеру быстрой заморозки для дополнительного затвердевания на 6 часов. Затем образцы подвергали сублимационной сушке и дополнительно исследовали. Цикл сублимационной сушки, использованный в этой серии экспериментов, был следующим: образцы подвергались первичной сушке при -40 ºC в течение 12 часов и вторичной сушке при 20 ºC в течение 6 часов. Во время этапов сушки давление в камере было постоянным и составляло 100 мкбар.

В экспериментах использовались образцы аэрированного кофе с концентрацией 50% и 60% (подготовка проб).

Характеристика образца

Лиофилизированные образцы исследуются с помощью теста на растворение и настольного СЭМ, как упоминалось ранее. Материалы и методы, использованные в этом исследовании, были представлены в этой главе. В следующих статьях будут представлены результаты и обсуждения работы, выполненной с использованием этих материалов и методов.